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想請問構成RNA二級結構的因素為何呢?且為何那麼熱門呢?

想請問構成RNA二級結構的因素為何呢?而在網路上時常看到關於RNA二級結構預測的研究和工具

不知此結構造成那麼熱門的原因是為何呢?
一、前言RNA多采多姿之功能為眾人所熟知(圖一)

不但是DNA基因體密碼解讀者(mRNA)

而且參與許多基本的生物功能

如轉譯合成蛋白質(rRNA及tRNA)

修剪形成成熟的RNA (Ribozyme)

調控DNA的複製(antisense RNA)

及構成RNA病毒的基因體。

此外

RNA也運用在生物科技上如RNA基因治療及運用RNA 干擾分子( R N A i 或RNAinterference) 抑制特定基因之表現。

細胞內RNA 主要有三類：信息RNA(mRNA)

核醣RNA (rRNA) 及胺基酸攜帶RNA (tRNA 簡稱攜帶RNA)。

信息RNA是於一九六一年由Brenner 等及Cros 等發現(Brenner et al.

1961; Gros et al.

1961)

迄今已五十年整。

目前研究已知信息RNA 是攜帶DNA的密碼

是以DNA為模板經由轉錄而產生。

信息RNA攜帶的密碼經轉譯解讀後產生蛋白分子

以執行細胞各種功能。

因此信息RNA的量與蛋白分子產量的關係密切。

即量高的信息RNA

就可轉譯高產量的蛋白分子。

除了信息RNA外

DNA密碼還可以轉錄出其他RNA分子

包括執行轉譯功能的核醣體RNA及攜帶RNA。

除此之外

尚有一些小而穩定性高的RNA分子

迄今其功能尚未完全明瞭。

細胞內無論那一種RNA的產量決定因素主要有兩個

即RNA轉錄的速度與RNA的穩定度。

在一九八○年代

有關RNA的研究趨科學發展月刊 科 學 發 展 月 刊專題報導National Science Council Monthly 661探討原核生物的RNA分解機制林淑端／中央研究院分子生物研究所向於其轉錄機制的調控。

而RNA的穩定度的調控機制則到一九九○年代才逐漸受到重視

同時探討RNA的技術也越趨成熟。

相較於DNA

RNA主要特徵之一是RNA本身非常不穩定

而造成RNA不穩定的機制直到一九九○年代才日趨明朗。

信息RNA壽命非常短暫

在原核細胞其半衰期約為數十秒到數分鐘之間。

而導致信息RNA如此不穩定的三個主要因素分別是RNA分解酶的活性、RNA二級及三級構造複雜、及兩者互動之狀況(圖二)。

因此要瞭解RNA穩定度

必需針對以上三個圖一　RNA多采多姿之功能RNA干擾分子增加植物抗病能力由RNA分子作為基因載體的感冒病毒多種RNA參與蛋白質的合成有作用的RNA (tRNA)未成熟的RNA分子合成中的蛋白質rRNAtRNAribozymemRNA核醣體A. 轉譯合成蛋白質D. RNA干擾分子C. RNA病毒基因體B. 修剪形成成熟RNA(RIBOZYME)第28 卷第9期科學發展月刊662專題報導因素作深入及系統性的探討。

二十世紀

本研究領域對原核生物RNA的分解機制有二項突破性發現

即坽發現細胞內

信息RNA的3'端具有外加多個腺核啟(adenosine) 或A序列

可促使該信息RNA快速分解；夌發現RNA分解體(RNAdegradosome)

並證明RNA分解體為細胞內執行RNA分解之工廠。

本研究計畫在國科會研究經費持續的補助下

不僅得以順利進行

且其成果對上述重要發現具有直接指標性作用。

因此

本研究成果在國際相關研究領域上

頗為知名。

二、研究目標及重要內容本研究計畫是一個具有連續性、多目標的長程計畫

目的在探討細菌RNA的分解機制

而全面性的目標在於瞭解RNA穩定性的機制。

其結果對於基因表現的控制

原核細胞的生長和DNA複製

及真核生物中細胞的抗病毒感染具有重大之影響。

本計畫是利用大腸桿菌(E. coli)

以核醣體RNA或是ColE1 型質體複製的antisense 抑制因子RNAI為模式系統

運用遺傳和生化方法針對調控RNA穩定性機制的所有因子進行研究

包括某些特定的基因、酵素、多成員蛋白複合體、受質RNA

以及環境和生理信號等

作成綜合性有系統的研究。

不論是原核或真核細胞分解mRNA都是由RNase 執行。

利用大腸桿菌系統

研究RNA分解機制的最大優點是大腸桿菌的遺傳基因只有一套

比較容易分離各種RNase 突變種

而且它的細胞週期很短。

自七十年代起

利用遺傳與生化研究方法從大腸桿菌系統鑑定了約二十種RNases 。

這些RNases 分為兩類：RNA內切酶與3'-端往5'-端切割活性的RNA外切酶(簡稱3'-端外切酶)；到目前為止在大腸桿菌系統5'-端RNA外切酶則尚未發現。

這些RNases 對細胞內各種RNA的成熟過程具有不同的功能。

例如RNaseIII 專切雙鏈區(doublestrandedregion)

RNaseE 則切RNA單鏈區(singlestrandedregion)；前者與23S 及16S rRNA形成有關

後者與5S rRNA形成有關(圖三A)。

又如RNaseP負責執行5'-端tRNA的成熟(5'end-processing) (圖一B)

此RNaseP活性乃是由它的RNA次單元(RNA subunit)來執行其功能。

到目前為止

這二十種RNases 中只有RNaseE 與RNaseP 是大腸桿菌必要的內切酶。

亦即缺少其中一種活性

細胞就無法存活； 而當除去RNaseIII 或其他任一種RNase 活性則不影響細胞生長。

利用遺傳突變研究法

D. Apirion 研究室於一九七八年鑑定分離出RNaseE 溫度敏感突變菌株(Ghoraand Apirion

1978)。

當時他們的研究發現RNaseE乃是負責執行成熟5S rRNA的內切酵素(圖三Ａ)。

於1985年

Apirion 研究室又發現RNaseE 可以切割負調控子RNAI (Tomcsanyi and Apirion

1985)。

當時本人覺得RNAI是研究RNA分解很好的模式

因為RNAI很小只有一○八核啟

它的二級結構與功能都已知

且RNAI不做轉譯

故其穩定度不受核醣體的干擾

做為研究系統比較單純。

近幾年來

研究RNA的學者亦經常引用RNAI作為分解模式

它的研究模式備受肯定。

研究計畫的第一階段乃是探討RNaseE 內切酶切割分解RNAI 的生化特性

包括RNA序列及二級結構

即RNase分解酶辨認切割RNA之特性。

第二階段圖二　原核生物訊息RNA的特性及調控RNA不穩定性之主要因子5’端穩定性控制元素3’端穩定性控制元素3’端外切酵素穩定RNA分子圖三　藉由RNaseE執行RNA成熟及RNA分解的功能達到蛋白質合成及質體DNA複製Endo-RNase 70S ribosomesEIFEIFEIFPPP5’3’A. 核醣體RNA成熟B. ColE1 質體複製5SrRNARNA I isdegraded byRNase EPlasmid DNAreplicationoccurs occursRNA processing9S RNARNase E科學發展月刊 科 學 發 展 月 刊專題報導National Science Council Monthly 663則探討RNAI分解途徑的機制

包括完全分解RNAI所需的RNA內切酶、外切酶及RNA3'端修飾酶之作用機制。

第三階段則是RNA分解體(工廠) 的發現。

其研究結果對於關鍵性生理過程中RNA分解之調控路徑

提出重要之基礎理論。

三、具體研究成果一九九一年

本研究室在中美國際合作計畫補助下證明RNaseE 切割RNAI 的確可調控RNAI 的穩定度

即調控RNAI分解速率。

並進一步印證了RNA分解速率可以調控DNA 之複製功能(Lin-Chao andCohen

1991) (圖三Ｂ)。

此研究成果首次闡明RNA穩定性可以調控重要之生物功能。

有關RNA穩定性及調控質體DNA複製之其他相關研究成果詳見參考文獻(Lin-Chao et al.

1992; Chao et al.

1995)。

一九九二至一九九五年的研究成果釐清RNaseE分解酶在受質RNA上的確認序列(McDowall et al.

1994; Lin-Chao et al.

1994; McDowall et al.

1995)。

RNaseE 確認的RNA序列一直不清楚

如Tomcsanyi和Apirion (Tomcsanyi and Apirion

1985) 提出ACAG(A/U) AUUUG 為其切割序列；而Ehretsmann 等人(Ehretsmann et al.

1992) 則提出RNaseE確認的RNA序列是RAUUW (R=A or G； W=A or U)。

而且

持這兩派理論的學者認為RNaseE 切割RNA時需要辨認特定之RNA二級結構。

因此釐清RNaseE的確認序列

即RNaseE 受質專一性

對研究它調控RNA分解是必要的。

我們的實驗結果發現

無論是在活體細胞內或利用半純化之RNaseE在試管內

RNaseE切割序列不限ACAG (A/U) AUUUG 或RAUUW 序列

而是多個A 與U 即可(McDowall et al.

1994; Lin-Chao et al.

1994)。

RNaseE可以切割寡核醣核酸(10-13 base) 其切割點與其在活體細胞內的切割點吻合。

首次證明RNaseE 切割不需要有RNA二級結構

而且更進一步證明後者可以抑制RNaseE對RNA受質的切割速率

即3'-RNAI 分子或其構造反而具有負性調控RNaseE 在切割序列的切割速率(McDowall et al.

1995)。

在這期間

並鑑定RNaseE溫度敏感株rne 基因的突變位址(McDowall et al.

1993)；首次發現3'端RNAI帶外加A的修飾

以加速RNAI分解

調控質體DNA的複製(Xu et al.

1993)

而從此RNA 的3'端外加A的修飾不再只是真核細胞的專利。

一九九六年提出RNaseE 分解RNA的調控機制。

首先我們證實

純化之RNaseE 蛋白本身具有內切切割活性

而RNaseE 除了具有切割RNA之活性外

它還具有鬆解RNA複雜結構的特性(Kaberdin et al.

1997)。

綜合上述發現

因為RNaseE 切割序列只需要多個A或U

我們推論在一個mRNA分子上應含有多個切割點

這些切割點可能被RNA分子上的結構或核醣體或其他相關結合子保護住

但是當某一個切割點被切割之後

其他切割點藉著RNaseE 鬆開RNA複雜結構之功能

可能同時被解開而隨即導致整個mRNA分子被RNaseE 分解。

此假說可以合理解釋目前細胞內mRNA分解的調控機制。

以上研究發現不但釐清了科學家過去對RNaseE 切割RNA條件的理論

而改變本學門專家對RNaseE受質專一性的認識。

一九九六年本研究室首次證實並成功地分離RNA分解體(RNA degradosome) (Miczak et al.

1996) (圖四)。

此研究結果發現

RNA分解體除了含有RNaseE內切分解酶及外切酶之外

其它結合的蛋白有RNAhelicase

Enolase 及DnaK。

此RNaseE複合蛋白體的圖示乃本研究室純化出之大腸桿菌細胞內負責訊息核醣核酸（message RNAs）降解（decay）之多蛋白複合體

最近我們研究發現

此複合體不但負責訊息核醣核酸的降解

連細胞內最穩定的核醣體核醣核酸（ribosomal RNAs）降解也在此進行

暗示此複合體乃為細胞內核酸代謝之主要工廠

研究發現發表於Proc. Natl.Acad. Sci. USA 95.pp. 3157-3161

March 1998圖四　RNA分解體RhlB HelicasePNPaseDnakEnolaseRNase EPPK第28 卷第9期科學發展月刊664專題報導發現

印證細胞內RNA的代謝或降解是由一群緊密相連結的蛋白成員巧妙地分工合作

有效率地完成(圖四)。

此發現在研究RNA分解之領域中

開啟嶄新之研究方向。

因此

多種RNA分解體已陸續在不同生物中被發現

研究中。

此研究成果發表於一九九六年美國四月三十日出刊的美國國家科學院彙刊(Miczak etal.

1996)

搶先英、法兩國學者於同年五月九日在Nature 上發表的相同研究發現(Py et al.

1996)。

次年

本研究室發現細胞生長環境因子藉由尚待發現的RNase 可以控制RNaseE 訊息RNA的分解(Woo andLin-Chao 1997)。

此研究發現暗示細胞生長環境因子與細胞內RNA分解途徑之密切關係。

而此未知RNase活性

尚待研究發現。

一九九八年自RNA分解體中分離並鑑定其結合RNA。

我們進一步發現RNaseE 的其它受質

包括穩定性特高的核醣RNA (rRNA)。

隨後我們證實RNaseE也是切割核醣RNA的主要內切酶

且純化之RNA分解體可以執行核醣RNA 之分解(Bessarab et al.

1998)。

三十多年來

生物學家一直認為核醣RNA為穩定型RNA。

在正常狀態

核醣RNA之分解不會發生。

我們的研究結果卻發現細胞內的RNA分解即是核醣RNA分解之工廠

而RNaseE為核醣RNA分解所需要之內切酶此研究發現

引發學者重新思考細胞內負責蛋白轉譯之核醣RNA與RNA分解體如何互動

因此打開另一個重要的研究方向

即細胞內之轉譯與RNA分解相遇時

細胞將如何調控？一九九九年發現並證明RNaseE可調控tmRNA (又稱10SaRNA或ssrA RNA) 的功能

乃執行細胞內分解“垃圾蛋白